b (1075)

پاياننامه کارشناسي ارشد رشته زيستشناسي-ميکروبيولوژي (M.Sc)
عنوان
بررسي مقايسهاي پروفايل پروتئيني مايکوباکتريوم توبرکلوزيس
و مايکوباکتريوم بوويس به روش SDS-PAGE
استاد راهنما
دکتر احمد رضا بهرمند
مشاور
دکتر مهناز سيفي
نگارنده
حانيه صرافي
سال تحصيلي 1392
چکيده
مايکوباکتريوم توبرکلوزيس عامل بيماري سل ميباشد. از زماني که سازمان جهاني بهداشت در سال 1993، توبرکلوزيس را به عنوان يک فوريت اعلام نمود، تا کنون کنترل آن به دليل وجود سوشهاي مقاوم به درمان و تداخل با بيماري ايدز دچار مشکل شده است. مايکوباکتريوم بوويس به عنوان عامل سل گاوي به صورت موردي انسان را نيز درگير مي کند و به عنوان يکي از معضلات بهداشتي با گستره جهاني محسوب ميشود. مبارزه با اين آلودگي امروزه باعث گسترش بررسي آنتيژنهاي باکتري به منظور دسترسي بيومارکرهاي موثر در تشخيص، اهداف دارويي و اجزاي واکسن مورد اهميت واقع شدهاند.
جهت مقايسه پروفايل پروتئيني سويههاي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس به درمان و مايکوباکتريوم بوويس از کل نمونههاي ارسالي 6 ماهه اول سال 1392 به بخش مايکوباکتريولوژي انسيتو پاستور، 100 نمونه مورد ارزيابي قرار گرفت. در ابتدا نمونههاي کلينيکي با روش ان استيل- ال سيستئين- هيدروکسيد سديم و در محيط کشت لونشتاين جانسون کشت داده شد و جهت افتراق مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس و مايکوباکتريوم بوويس از ساير مايکوباکتريومها، از تستهاي بيوشيميايي (نيترات، کاتالاز، نياسين و TCH) و حساسيت آنتي بيوتيکي استفاده شد. کلونيها در محيط ميدل بروک 7H9 کشت داده شد، پس از برداشت کلونيهاي جديد، به منظور استخراج پروتئينهاي ترشحي و غشايي از روشهاي سونيکاسيون، رسوب دهي با سولفات آمونيوم و الکل استفاده گرديد و به وسيله روش برادفورد تعيين غلظت شد و در نهايت مقايسه با روش الکتروفورز تک بعدي انجام پذيرفت.
با بررسي باندهاي حاصله از پروتئينهاي غشايي و ترشحي در 5 سويه کلينيکي متفاوت مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس هيچگونه تفاوتي مشاهده نشد و همچنين در 5 سويه کلينيکي متفاوت مايکوباکتريوم بوويس نيز تفاوتي مشاهده نشد. در سويههاي مايکوباکتريوم بوويس، براي پروتئينهاي غشايي باندهايي در محدوده 15 تا 85 کيلودالتون مشاهده شد و در سويه مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس نيز باندهاي از 15 تا 120 کيلودالتون مشاهده شد اين دو سويه در محدودههاي وزني تقريبا 30 تا 116 کيلو دالتون بسيار متفاوت بودهاند.
در بررسي پروتئينهاي ترشحي در سويههاي مايکوباکتريوم بوويس، باندهايي در محدوده 15 تا 115 کيلودالتون و در سويههاي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس باندهايي از 18 تا 114 کيلودالتون مشاهده شدند که اختلافات وزني کمي در اين محدودهها مشاهده شد.
نتايج حاصل از تفکيک باندهاي پروتئيني سويههاي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس، حاکي از شباهت نسبي با سويه استانداردM. tuberculosis H37Rv نسبت به مطالعات ديگر است. اختلافات مشاهده شده در باندهاي حاصله از هر دو نوع پروتئينهاي سويههاي مايکوباکتريوم بوويس و مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس ميتواند مرجعي براي بررسيهاي بيشتر پروتئوميکس در باکتري مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس و بوويس باشد.
به نظر ميرسد اختلاف بيان باندهاي پروتئيني سويههاي حساس و بوويس با به کارگيري روشهاي مناسب ميتواند به عنوان پروتئين مارکر و يا حتي بيومارکر موثر در تشخيص سويههاي حساس و بوويس از يکديگر، اهداف دارويي و اجزاي واکسن قابل استفاده باشد.
فهرست مطالب
چکيده1فصل اول- مقدمه31-1. کليات سل41-2. بيان مسئله51-3. اهميت و ضرورت71-4. اهداف8فصل دوم- پيشينه تحقيق92-1. تاريخچه102-2. مايکوباکتريومها112-3. طبقهبندي مايکو باکتريومها122-3-1. فتو کروموژن132-3-2. اسکوتوکروموژن132-3-3. غير کروموژن142-3-4. سريع الرشد142-4. باکتريولوژي سل142-5. مورفولوژي و خصوصيات ميکروسکوپي152-6. خصوصيات رشد162-7 . فيزيولوژي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس172-7-1. انتقال مواد غذايي توسط غشاء خارجي182-7-2. انتقال توسط غشاء داخلي182-7-2-1. انتقال ترکيبات حاوي کربن182-7-2-2. انتقال ترکيبات غير کربن192-8. فاکتورهاي ويرولانس201-9. ديواره سلولي212-10. بيوشيمي ديواره سلولي232-11. بيماريزايي232-11-1. مکانيسم بيماريزايي252-12. درمان سل262-12-1. درمان سل حساس به دارو262-12-2. درمان سل مقاوم به دارو262-13. مقاومت دارويي مايكوباكتريوم توبركلوزيس272-14. مکانيسم مولکولي مقاومت دارويي282-14-1. مقاومت به ريفامپين282-14-2. مقاومت به ايزونيازيد292-14-3. مقاومت به پيرازين آميد292-14-4. مقاومت به اتامبوتول302-14-5. مقاومت به استرپتومايسين302-14-6. فلورو کينولونها302-14-7. آمينوگليکوزيدها312-14-8. سيکلوسرين312-14-9. پاراآمينوساليسيليک322-15. انواع سل332-15-1. سل ريوي332-15-2. سل خارج ريوي332-15-2-1. سل عقدههاي لنفاوي332-15-2-2. سل پلور342-15-2-3. سل استخواني342-15-2-4. سل سيستم عصبي مرکزي342-15-2-5. سل شکمي342-15-2-6. سل دستگاه تناسلي352-15-2-7. سل پريکارديت352-15-2-8. سل ارزني352-16. سل در کودکان362-17. سل و ايدز362-18. روشهاي تشخيص سل372-18-1. تست پوستي372-18-2. کشت372-18-3. تهيه اسمير382-18-4. تکنيک PCR382-18-5. بررسي اينترفرون گاما382-18-6. راديوگرافي ريه392-19. اپيدميولوژي392-19-1. وضعيت بيماري سل انساني در ايران412-20. مايکوباکتريوم بوويس442-20-1. اهميت سل گاوي 452-21. مايکوباکتريوم بوويس ب.ث.ژ452-21-1. فيلوژني452-21-2. تاريخچه BCG482-21-3. تاريخچه توليد و مصرف واکسن ب.ث.ژ در ايران502-21-4. ايمنيزايي512-21-5. لزوم طراحي واکسن جديد522-22. پروتئوميکس مايکوباکتريومها532-23. پيشينه تحقيق پروتئوميکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس و بوويس58فصل سوم- مواد و روشها613-1. نمونهگيري 633-2. کشت و جداسازي باکتري 643-2-1. مواد مورد نياز براي توليد محيط لوون اشتاين جانسون به ميزان 5/1 ليتر643-2-2. طرز تهيه محيط کشت643-2-3. آلودگيزدايي و تغليظ نمونهها653-2-3-1. آماده سازي محلولها663-2-4. روش کار کشت663-2-4-1. محيط کشت حاوي تيوفن 2- کربوکسيليک اسيد هيدرازيد673-3. تشخيص ميکروسکوپي مايکوباکتريومها 673-3-1. تهيه گستره673-3-2. رنگآميزي اسيد-فست فلورسنس اورامين O683-3-3. رنگآميزي ذيل- نلسون 693-3-4. رنگآميزي کينون (رنگآميزي سرد)703-3-5. بررسي و آزمايش گسترش 713-4. بررسي لولههاي کشت 713-5. شناسايي و تعيين هويت مايکوباکتريوم توبرکلوزيس و بوويس723-5-1. تست نياسين772-5-1-1. معرفها و مواد لازم تست نياسين723-5-1-2. آمادهسازي محلولها ي نياسين723-5-1-3. مراحل کارتست نياسين733-5-2. آزمونهاي احياي نيترات733-5-2-1. معرفها و مواد لازم تست نيترات733-5-2-2. آمادهسازي معرفهاي تست نيترات 743-5-2-3. مراحل انجام کار تست نيترات743-5-2-4. استانداردهاي احياء نيترات743-5-3. تست کاتالاز753-5-3-1. محيط و مواد مورد نياز763-5-3-2. آمادهسازي محلولهاي تست کاتالاز763-5-3-3. مراحل انجام آزمايش روش نيمه کمي کاتالاز و کاتالاز 68 درجه763-5-3-4. نتايج و تفسير آزمايش کاتالاز773-5-4. حساسيت به تيوفن 2- کربوکسيليک هيدرازيد (TCH)773-6. آزمايشات حساسيت داروئي در مايکوباکتريومها 773-6-1. تهيه محلول استاندارد مک فارلند783-6-2. تهيه سوسپانسيون باکتري 783-7. کشت سويههاي انتخابي در محيط ميدل بروک 7H9783-7-1. مواد مورد نياز783-7-1-1. آمادهسازي محيط783-7-1-2. انتحاب سويهها و کشت803-8. جمعآوري سويهها ميکروبي، استخراج و خالصسازي پروتئين803-8-1. استخراج پروتئينهاي غشايي803-8-1-1. مواد مورد نياز803-8-1-2. تهيه بافر و محلولها803-8-1-3. روش کار813-8-1-4. استخراج پروتئينهاي ترشحي813-8-2. خالصسازي پروتئين813-8-2-1. مواد مورد نياز813-8-2-1-1. آمادهسازي محلولها و مواد813-8-2-1-2. روش کار ترسب پروتئينهاي غشايي833-8-2-1-3. ترسيب پروتئينهاي ترشحي833-8-2-2. تعيين غلظت پروتئينها843-8-2-2-1. مواد مورد نياز843-8-2-2-2. آمادهسازي محلول برادفورد853-8-2-2-3. روش کار853-9. الکتروفورز ژل پلي آکريل آميد(تک بعدي)853-9-1. مواد مورد نياز863-9-2. آمادهسازي مواد863-9-3. روش کار883-9-3-1. رنگآميزي کوماسي بلو R-250903-9-3-2. رنگآميزي Blue Silver Staining903-10. تصوير برداري و آناليز ژلها90فصل چهارم- نتايج914-1. جمعيت مورد مطالعه924-2. درصد سويههاي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس جمعآوري شده از بيماران با توجه به موضع جداسازي934-3. مشاهده لام رنگآميزي اسيد-فست فلورسنس اورامين O934-4. مشاهده لام رنگآميزي ذيل-نلسون944-5. نتايج کشتها944-6. آزمونهاي بيوشيميايي وحساسيت آنتيبيوتيکي954-7. نتايج تعيين غلظت پروتئينها974-8. نتايج مربوط به تفکيک پروتئينها بر اساس وزن مولکولي98فصل پنجم- بحث و نتيجه گيري 102پيشنهاد 108منابع 109چکيده انگليسي 117
فهرست نمودارها
2-1: ميزان بروز بيماري سل در طول 46 سال گذشته در ايران414-1: نتايج کشت مثبت924-2: منحني استاندارد98
فهرست جداول
2-1: تاکسونومي اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس152-2: داروهاي خط دوم درمان توبركلوزيس322-3: تخمين موارد ومتوسط ميزان بروز سل در جهان در سال2010402-4: به تفکيک دانشگاههاي علوم پزشکي کشور422-5: برخي تغييرات ژني در سويههاي BCG M. bovis473-1: نحوه گزارش ميکروسکوپي713-2: مواد تشکيلدهنده بافرتخليص813-3: مواد تشکيلدهنده محلول PBS x10833-4: مواد تشکيلدهنده محلول برادفورد853-5: مواد تشکيلدهنده Running Buffer 10%863-6: مواد تشکيلدهنده Coomassie Gel stain873-7: مواد تشکيلدهنده Coomassie Gel Destain873-8: مواد تشکيلدهنده Fixation solution873-9: مواد تشکيلدهنده Stainining solution883-10: مواد تشکيلدهنده ژل 10%,12.5% Separating893-11: مواد تشکيلدهنده ژل Stacking 5%894-1: درصد نمونههاي باليني934-2: نتايج تستهاي بيوشيميايي964-3: نتايج تستهاي حساسيت آنتيبيوتيکي و TCH97
فهرست تصاوير
2-1: استخوان سـتون فقرات بدشـکل در موميايي، بهدليل بيماري سـل 112-2: عکسبرداري توسط ميکروسکوپ الکتروني از مايکوباکتريوم توبرکلوزيس162-3: کلنيهاي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس روي محيط لونشتاين جانسون172-4: نماي شماتيک ازساختمان ديواره مايکوباکتريوم توبرکلوزيس222-5: ميزان بروز مايکوباکتريوم توبرکلوزيس درنقاط مختلف جهان در سال 2012402-6: درخت تبارشناسي زيرسويههاي مختلف BCG M. bovis بر اساس اطلاعات پراکندگي آنها و خصوصيات مولکولي462-7: برخي از عکسهاي تاريخي مربوط به کاشفان واکسن ب ث ژ493-1: مرحله دياليز843-2: آمادهسازي صفحات شيشهاي884-1: باسيل اسيد فست در رنگ اميزي اورامين934-2: باسيل اسيد فست در رنگ اميزي ذيل-نلسون944-3: فاکتور طنابي (cord factor)954-4: تفسير تست نيترات954-5: باندهاي پروتئينهاي غشايي سويههاي M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئين به روش آمونيوم سولفات، ژل 10% و رنگ آميزي آميزي کوماسي بلو R-250994-6: باندهاي پروتئينهاي غشايي سويههاي M. bovis و M. TB ، استخراج پروتئين به روش آمونيوم سولفات، ژل 10% رنگ آميزي Blue Silver Staining1004-7: باندهاي پروتئينهاي ترشحي سويههاي M. bovis و M. TB 1015-1: تصوير A سويهM. tuberculosis H37Rv و تصويرB سويه مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حساس 106

فصل اول
مقدمه
1-1. کليات سل
سل بيماري است که از ديرباز در بين جوامع مختلف شيوع داشته است و عامل آن را از اسکلت انسانهاي عصر حجر و استخوانهاي موميايي شده مصريان باستان جدا کردهاند .(Zink A R. et al., 2003) امروزه يكي از بزرگترين مسائل بهداشتي جهان، بيماري سل است. حدس زده ميشود كه از هر سه نفر جمعيت جهان، يك نفر به باسيل سل آلوده بوده و درهر ثانيه يك نفر به تعداد آنان افزوده ميشود. نگران كننده اين است كه طبق برآوردهاي موجود 50 ميليون نفر از اين افراد، به باسيل سل مقاوم به چند دارو (MDR-TB) آلوده هستند. درحال حاضر 12 ميليون نفر درجهان به بيماري سل مبتلا هستند كه بيش از 80% اين موارد، تنها مربوط به 22 كشور درحال توسعه جهان است.
در سال 2010 ميلادي، حدود 8/8 ميليون نفر جديد به سل فعال مبتلا شده و حدود 1/1 ميليون نفر در اثر اين بيماري جان ميسپارند. بيش از 90% موارد بيماري و مرگ ناشي از سل در كشورهاي در حال توسعه رخ ميدهد، كشورهايي كه 75% موارد بيماري در آنها به فعالترين گروه سني به لحاظ اقتصادي (يعني 15 تا 54 سالگي) تعلق دارد.
آلودگي همزمان به ويروس ايدز خطر ابتلا به بيماري سل را به طور معنا داري افزايش ميدهد. كشورهاي با شيوع بالاي HIV، به ويژه كشورهاي واقع در افريقاي زير صحرا، شاهد افزايش چشمگير تعداد بيماران مبتلا به سل و افزايش 2 تا 3 برابر ميزانهاي بروز گزارش شده سل در دهه 90 بودهاند. در سال 2010، ميزان شيوع عفونت اچ آي وي در ميان بيماران مبتلا به سل در جهان 13% تخمين زده شده است (W.H.O., 2010).
سل يک بيماري تنفسي است که راه عمده سرايت آن ذرات تنفسي1 وخلط سينه بيماران2 ميباشد. اما روشهاي سرايت ديگري همچون تلقيح مستقيم باسيل سل در پوست مجروح کساني که با بافت آلوده سروکار دارند نيز توصيف شده است. ورود باسيل سل به بدن يک فرد ضرورتا ايجاد بيماري سل نميکند، اولين فاکتورهاي افزايش دهنده امکان ابتلاء فرد آلوده شده، خصوصيات شخصي هر فرد (مانند سن، جنس، ساختمان بدن و حساسيت ژنتيکي)، عوامل اجتماعي (مانند فقر غذايي و شرايط زيستي) و عواملي نظير سرکوب سيستم ايمني3 ناشي از داروهاي استروئيدي يا بيماريهايي نظير سرطان خون، بيماريهاي دستگاه رتيکولواندوتليال، ديابت شيرين4، بيماريهاي قارچي سيستميک و ايدز5 ميباشد (Jonas V. et al., 1993).
کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس (MTB) 6که شامل مايکوباکتريوم توبرکلوزيس7، افريکانوم8، بوويس9، بوويس10BCG، کاپرهاي11، ميکروتي(mycobacterium microti)، پنيپدي، dassie bacillusو کانتي (mycobacteriu canettii)، گرچه خصوصيات فنوتيپي متفاوتي در تستهاي بيوشيميايي از خود نشان ميدهند اما همولوژي بالايي به لحاظ ژنتيکي دارند .(Somoskovi A. et al., 2007)افتراق اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس براي پيشبرد درمان موفق ضروري است بالاخص در مناطقي که بيماري به صورت اپيدميک در ميآيد يا تماس انسان و حيوان زياد است .(Barouni A.S. et al., 2004)
همانطور که ذکر شد M. bovis يکي از قديميترين و مهمترين عامل بيماري سل بين انسان و دام (Zoonoses) و به عنوان يکي از معضلات بهداشتي با گستره جهاني محسوب ميشود. ميزان مرگ و مير ناشي از M. bovis بيشتر از M. tuberculosis ميباشد .(Majoor C.J. et al., 2011) تشخيص M. bovis و M. bovis BCG از ديگر اعضاي کمپلکس MTB بدليل مقاومت ذاتي (Scorpio A. et al., 1997) آنها به آنتي بيوتيک پيرازيناميد12 از اهميت راهبردي برخوردار است .(Jure´en P. et al., 2008)اين در حالي است که مقاومت به پيرازيناميد در مايکوباکتريومهاي غير کمپلکس MTB عموميت ندارد .(Sun Z. et al., 1997) پيرازيناميد جزو داروهاي خط اول مقابله با بيماري سل و قادر به از بين بردن باکتريهاي غير فعال و احتمالا داخل سلولي است. اين خصوصيات امکان کاهش زمان درمان از ??-?? ماه به ? ماه را امکانپذير ميکند (Lee K.W. et al., 2001).
روشهاي کلاسيک افتراقM. tuberculosis و M. bovis و تستهاي حساسيت به دارو بر پايهي احياي نيترات13، فعاليت آنزيم پيرازيناميداز (Pyrazinamide)، تجمع نياسين و رشد در محيط تيوفن ?-کربوکسيليک اسيد هيدرازيد14 استوار است .(Monteros L. et al., 1998)
1-2. بيان مسئله
در حال حاضر سل بيش از ساير بيماريهاي عفوني ديگر مانند مالاريا (Malaria)، ايدز و بيماريهاي گرمسيري Tropical diseases)) در بين جمعيت بالاي 5 سال تلفات دارد. طبق برآوردها در سال 2011، 7/8 ميليون مورد جديد سل (13% ابتلا مشترک با HIV ) ديده شد که 4/1 ميليون نفر در اثر ابتلا جان خود را از دست داده که از اين تعداد سهم ابتلا مشترک با HIV 430000 نفر بوده است .(who., 2011) يک فاکتور مهم براي پيشرفت به توبرکلوزيس فعال در افراد با عفونت نهفته توبرکلوزيس ميشود. عامل مرگ و مير در جهان در مقايسه با سرخک15 (با 2ميليون مرگ در جهان) و مالاريا (با يک ميليون مرگ در جهان) محسوب ميگردد. بنابر گزارش سازمان بهداشت جهاني (W.H.O) و مرکز کنترل بيماريها در آمريکا (CDC) سل مسئول حدود 27% از موارد مرگ ومير در سراسر جهان ميباشد.
باتوجه به اينکه تنها راه محافظت از افراد سالم جامعه در برابر سل، ايمنيسازي، تشخيص سريع و درمان به موقع و کامل بيماران خواهد بود و نکته قابل توجه اينکه پيدايش سويههاي M. tuberculosis مقاوم به آنتيبيوتيک16 و عدم کارايي واکسن BCG در بزرگسالان، تلاش براي دستيابي و گسترش ابزارهاي تشخيص، پيشگيري و درمان سل يک ضرورت جهاني شده است .(Barker L.F. et al., 2009)
BCG تنها واکسن در دسترسي عليه توبرکلوزيس است که شامل يک خانواده هتروژنوس از يک زير سويه با ژنوتيپ و فنوتيپ مشخص است. سازمان جهاني بهداشت عنوان کرده است که تشخيص زيرسويههاي BCG در هر دو سطح ژنوميک (Genomic) و پروتئوميک (Proteomics) براي دستيابي به پاسخ ايمني مناسبتر، لازم است .(Berredo-Pinho M. et al., 2011)
واكسنBCG نميتواند از عفونت M. tuberculosis جلوگيري كند ولي از فرمهايهاي شديد بيماري ممانعت ميكند. همچنين در افراد آلوده به M. tuberculosis، واكسيناسيونهاي بعدي با واكسن BCG باعث بالارفتن قدرت سيستم ايمني نميشود.
بيشتر آنتيژنهاي مورد استفاده در واکسنهاي نوترکيبBCG در پروتئينهايي به شدت غير قطبي وجود دارند که خود اين امر مسائلي را براي توليد اين پروتئينها به منظور مصارف واکسن به همراه دارد .(Macedo G.C. et al., 2011)
در سال 1998،cole و همکاران، به تعيين توالي کامل ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوريسH37RV پرداختند و توانستد 3924 ژن منفرد را تعيين توالي کنند و به کمک اين اطلاعات ژنتيکي مکمل، آناليز پروتئوم به کمک ترکيبي از روشهاي الکتروفورز دو بعدي و mass specterometry صورت گرفت (Britton W.J. et al., 1987). حدوداً 800 پروتئين ترشحي كد شونده توسط ژنوم M. tuberaulosis شناخته شده است.
در سال 1999،jungblut و همکاران از طريق مقايسه ژنتيکي به بررسي پروتئوم دو سويه غير ويرولانس مايکوباکتريوم بوويس BCG(Chicago and Copenhagen) با دو سويه وحشي، M. tuberculosis (H37RV and Erdman) پرداختند تا از اين طريق پروتئينهاي مناسب براي توسعه دادن واکسن جديد تشخيص داده شود و در درمانهاي جديد به کار رود. اين سويهها به وسيلهSDS- page و الکتروفورز دوبعدي آناليز شدند. ويژگيهاي پروتئينها به وسيله طيفسنجي جرمي شناسايي و به وسيله پايگاه دادهاي از الکتروفورز دو بعدي معرفي شد که 263 پروتئين مايع رويي کشت مايکوباکتريومي شناسايي شد. از اين تعداد 54 مورد متعلق به سوپرناتانت کشت بوده، 16 پروتئين متفاوت از نظر شدت و موقعيت بين مايکوباکتريوم توبرکلوزيسH37RV وErdman و 25 پروتئين متفاوت از نظر شدت و موقعيت بين M. tuberculosis H37RV و M. bovis BCG شناسايي شد (Jungblut P.R. et al., 1999).
در سال 2003، Jens Mattow و همکاران، آناليز فراگير پروتئينهاي سوپرناتانت کشتM. tuberculosis H37RV به کمک ترکيب روشهاي الکتروفورز 2 بعدي، mass spectrometry و تعيين تواليN-terminal پرداختند. آناليز ژل الکتروفورز دو بعدي حدود 1250 قطعه پروتئين را ازM. tuberculosis H37RV شناسايي شد. اين مطالعه 137 پروتئين مختلف را نشان داد که 42 تا از آنها قبلاً به عنوان پروتئين ترشحي توضيح داده شده و از مقايسه پروتئوم ازM. tuberculosis H37RV و M. Bovis BCG Copenhagen ضعيف شده 39 تکه پروتئين مخصوصM. tuberculosis را نشان داد که داراي 27 پروتئين مختلف بودند که مي تواند به عنوان کانديدي از آنتيژنها براي تهيه واکسني جديد باشد (Mattow J. et al. 2003). در بين پروتئينهاي مشخص شده در پروتئوم مايکوباکتريومها، تعدادي هستند که بعنوان آنتيژنهاي مايکوباکتريايي ارزش بالقوهاي در توليد واکسن دارند و همچنين ارزش تشخيصي هم دارند. اين پروتئينها شامل آلانيندهيدروژناز17Hsp6018(RV0440) (RV2780)،Hsp70 (RV0350) ، اعضا کمپلکس آنتيژن85 کيلودالتوني، ?کريستالين و آنتيژن35 کيلودالتوني از مهمترين موارد هستند. پروتئين34 کيلودالتوني بنام آنتيژن 84 در مايکوباکتريوم کانزاسي19 و بوويس BCG، مايکوباکتريوم لپره20 و M. tuberculosis وجود دارد .(Komiya K. et al., 2011 ; Farshadzadeh Z. et al., 2010)
1-3. اهميت و ضرورت
چالشهاي زيادي در برابر توليد واكسن موثر برعليه سل وجود دارد. با مطالعات انجام شده تخمين زده ميشود که 3/1 جمعيت دنيا با M. tuberculosis آلودهاند. هر واكسن جديد بر عليه بيماري توبركلوزيس بايد جهت استفاده در جمعيت مناسب باشد. همچنين در افرادي كه خطر فعال شدن بيماري در آنها بسيار زيادتر است (مثل افراد آلوده به HIV كه با M. tuberculosis نيز آلودهاند)، واكسن جديد بايد بتواند به عنوان يك داروي محرك ايمني21 به همراه داروي پروفيلاكسي در پاكسازي بدن از باكتري موثر باشد.
مطلب قابل توجه ديگر اينکه افراد زيادي با BCG واكسينه شده اند، لذا هر واكسن موثر جديد بايد بتواند اين جمعيت بزرگ را كه با BCG واكسينه شدهاند را نيز در برابر عفونت توبركلوزيس محافظت كند (Martin C., 2005). همچنين تشخيص و درمان بموقع بيماري نيز از اهميت خاصي برخوردار است.
تمامي چالشها محققان زيادي را در مراكز تحقيقاتي دنيا مشغول مطالعه استراتژيهاي جديد واكسيناسيون بر عليه توبركلوزيس کرده است تا بتوانند واكسني موثرتر از واكسن حال حاضر يعني BCG معرفي نمايند.
يکي از راه کارهاي مناسب، بررسي پروفايل پروتئيني سويههاي M. tuberculosis و M. bovis است، که مطالعهي پايلوت را به منظور تفاوت در الگوي پروتئينها بيان ميکند.
آناليز پروتئيني باکتريها بسته به روش جداسازي آنها اهميت خاصي دارد. ترکيب خاص از روشهاي مختلف از جمله SDS-page22 و الکتروفورز دوبعدي23 ميتواند منجر به ارائه اطلاعات مفيدي درخصوص پروتئينهاي اختصاصي باکتريها شود.
1-4. اهداف
پس از بررسي تفاوت در الگوي پروتئينها با روش SDS-page، در ادامه ميتوان با تکنيکهاي مناسب پروتئينهاي اختصاصي باکتريها را معرفي نمود و با مقايسه آنها به روشهاي نوين تشخيصي، درماني و پيشگيري رسيد .(Mollenkopf HJ. et al., 2004) اگر چه تا به حال اطلاعات كامل ژنوميك و پروتئوميك در مورد M. tuberculosis بدست آمده است ولي متاسفانه هنوز كانديدهاي مناسب واكسن شناخته نشدهاند. هيچ كدام از واكسنهاي پروتئيني و DNA نيز نتوانستهاند تاكنون مصونيت بخشي بهتر از واكسن BCG را القاء نمايند اما در موش توانستهاند مصونيتهاي نسبي بر عليه عفونت M. tuberculosis راتوليد نمايند. فرمولاسيون هاي جديد آنتيژن مثل استفاده از آنتيژنهاي متعدد يا اپيتوپهاي متعدد، در حال تحقيق و بررسياند .( Martin C., 2005)
فصل دوم
پيشينه تحقيق
2-1. تاريخچه
بيماري سل از دير باز در جوامع انساني شايع بوده و در اسكلت انسانهاي عصر حجر و نيز در استخوان هاي موميايي شده در مصر فرم غيرريوي (سل مهرهاي) يافت گرديدهاست (تصوير2-1). بقراط پزشک يوناني در 460 سال قبل از ميلاد مطالبي در مورد اين بيماري و علائم آن نوشته است. جالينوس (130 سال قبل از ميلاد) بيماري سل را مداوا مينمود و به جدا کردن بيماران از ديگران اعتقاد داشت (Dufault P., 1941). محمد ذکرياي رازي (953-850 ميلادي) و ابوعلي سينا (1037-980 ميلادي) علائم بيماري را در بيماران خود توصيف نمودهاند (Grigy E., 1958).
با اين وجود نخستين بار ماهيت بيماري سل، به وسيله ويلمين در سال 1865 شناخته شد. او ثابت كرد كه اين بيماري، مسري بوده و اگر از ضايعات سل انسان به كبك يا خرگوش تزريق گردد، در حيوانات ايجاد بيماري مي‌شود اين بيماري كه اولين بار فساد بافت ناميده شد، بعنوان بيماري مسري در بين اقوام مديترانه در قرن 16 شناخته گرديد (Segundo. et al., 2000).
در قرن 19 بيماري سل به عنوان طاعون سفيد24 شناخته شد که مسبب مرگ و مير بسياري در اروپا و امريكا بود. چنانچه تخمين ميزان مرگ و مير ناشي از اين بيماري در سال 1830 بسيار بالا بوده است (از هر 000/100 نفر 400 نفر). در سال 1882، اين باكتري بوسيله رابرت كخ25 كشف گرديد و به همين جهت، آن را باسيل كخ نيز ‌ناميدهاند. كخ توانست باكتري را از خلط و ضايعات بيمار به دست آورد و براي اولين بار، اين باكتري را بر روي محيط سرم منعقد شده گاو و گوسفند كشت داد. علاوه بر اين، با تلقيح به حيوان حساس، در حيوان ايجاد بيماري نمود و از حيوان، باكتري اوليه را بدست آورد. اين روند امروزه بنام اصول كخ معروف است. با شروع قرن 19، پزشكان دو ابزار مهم جهت تشخيص سل در دست داشتند:
1 – تشخيص عامل بيماريزايي به وسيله ميكروسكوپ (رابرت كخ در 1905)
2- اشعه X از سينه (ويليام كونارد در 1901).
امروزه هم اين دو روش همچنان ابزارهاي پايه تشخيص سل ميباشند (Boer As. et al., 1999). از جمله تحقيقات مهم در زمينه سل، کشف ساختار مقاوم به اسيد و الکل با کمک رنگآميزي با روش ذيل نلسون در اين باکتري مي‌باشد. اساس اين رنگ‌آميزي با مشارکت ارليش، ذيل و نلسون26 شکل گرفت. تشخيص افتراقي باسيل سل مرغي در انسان به ترتيب در سال 1889 توسط ريولتا27 و 1890 توسط مافوکي28 انجام گرديد. توبرکولين در سال 1891 توسط کخ تهيه شد و بعدها در سال 1902 باسيل سل گاوي توسط اسميت شرح داده شد (Kalkut G., 2000).
اولين آنتيبيوتيكهايي كه جهت درمان بيماري سل به كار گرفته شدند، استرپتومايسين (Streptomycin) و پاراآمينوساليسيك اسيد (para aminosalicylic acid) بوده كه در دهه 1940 تجويز شدند. اين داروها به طور موفقيت آميزي به صورت مجزا تجويز ميشدند ولي بعد از مدت کوتاهي، مقاومت نسبت به اين دو دارو ديده شد. در اواخر دهه 1950، ايزونيازيد (isoniazid) را به رژيم درمان سل اضافه كردند. در ابتدا اتامبوتول و سپس در اول دهه 1970، ريفامپين معرفي شدند. پس از سه دهه، داروهايي به رژيم دارويي سل اضافه شد كه در فاز I و II موارد باليني مورد استفاده قرار ميگيرند (Yam WC., 2006).
داروهاي انتخابي خط دوم در درمان سل شامل فلوروکينولونها، آميكاسين‌، كانامايسين، كاپرئومايسين، اتيوناميد، پاراآمينوسياليسيك اسيد، سيكلوسرين، تياكتازون ميباشند. تمامي داروهاي خط دوم درمان، گران قيمت بوده و كارايي و ويژگي پاييني داشته و سميت بالايي دارند (Limeschenko E. et al., 2008).
تصوير2-1: موميايي يافت شده در کـشور مصر،استخوان سـتون فقرات داراي بدشـکلي Pott،
کـه بهدليل بيماري سـل ايـجاد ميشود.
2-2. مايکوباکتريومها
مايکوباکتريومها، ارگانيسمهاي ميلهاي شکل، نازک و بدون تحرک متعلق به خانواده مايکوباکترياسه و رده اکتينوميستالها و کلاس اکتينومايسه ميباشند ( .(Rastogi N. et al., 200lدر حال حاضر تا ژانويه سال 2010 تعداد 158 گونه مختلف در جنس مايکوباکتريوم شناسايي شده است (Limeschenko E. et al., 2008). اين گونه ها طيف وسيعي از عفونتهاي موضعي تا بيماريهاي منتشر را در انسان و حيوانات ايجاد مي کنند. اگرچه بعضي از گونهها فقط در انسان عفونت ايجاد ميکنند، ساير گونهها از حيوانات گوناگوني جدا شدهاند. همچنين گونههاي زيادي در آب و خاک يافت شدهاند. از بسياري جهات، مايکوباکتريومها را بر اساس تفاوتهاي بنيادي در اپيدميولوژي و بيماري، به دو گروه اصلي:
1-کمپلکسمايکوباکتريومتوبرکلوزيس (مايکوباکتريوم توبرکلوزيس، مايکوباکتريوم آفريکانوم، مايکوباکتريوم بويس، مايکوباکتريوم ميکروتي و مايکوباکتريوم کانتي) که کند رشد و کلني آنها فاقد پيگمان ميباشند .
2- مايکوباکتريومهاي غير توبرکلوزيس NTM29) ياMOTT30 ) تقسيم ميکنند (Collins C.H. et al., 1997).
2-3. طبقهبندي مايکوباکتريومها
با ظهور تکنولوژي تعيين توالي اسيدهاي نوکلئيک و ژنوتايپينگ اين امکان به وجود آمده است که ارتباط بهتري در توصيف مجدد ژنوتايپينگ و فنوتايپينگ موجود، فراهم شود. چنانچه اين موضوع در تشخيص گونههاي جديد هم موثر بودهاست. نامگذاري باکتريها به وسيله کد بين المللي صورت گرفته و نام صحيح مربوط به طبقه باکتري بر اساس درج باکتري در منابع معتبر علمي که داراي نشر طولاني و اعتبار قانوني در مجامع علمي هستند صورت ميگيرد. از اوايل ژانويه 1980 نام باکتريهاي قبلي بر اساس ليست تائيد شده نامگذاري باکتري31 انجام گرفت و هر باکتري که نام آن در ليست موجود نبود در نامگذاري قرار نميگرفت. براساس علائم کلينيکي مهم، مايکوباکتريوم‌ها به 3 گروه اصلي طبقه‌بندي مي‌شوند:
1- شديداً پاتوژن، از جمله پاتوژن‌هاي انساني شامل مايکوباکتريوم توبرکلوزيس و مايکوباکتريوم لپره و پاتوژن‌هاي حيواني شامل مايکوباکتريوم بوويس.
2- پاتوژنهاي فرصتطلب (يا پاتوژنهاي بالقوه) شامل مايکوباکتريوم سيميه32، مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم گزنوپي33.
3- ندرتاً پاتوژن شامل ساپروفيتهايي مانند مايکوباکتريوم فله‌اي34 و مايکوباکتريوم اسمگماتيس35.
در ميان پاتوژن‌هاي بالقوه عبارت کمپلکس مايکوباکتريوم آويوم، مايکوباکتريوم اينتراسلولار-مايکوباکتريوم اسکوروفولاسئوم36 (MAIS) قبلا به گروهي از مايکوباکتريوم‌هاي کند رشد اطلاق مي‌شد که از نظر خصوصيات ظاهري به هم شبيه و در برخي مواقع تفريق آنها از يکديگر مشکل بود (Collins C.H. et al., 1997). امروزه واژه MAIS کاربرد چنداني ندارد بطوريکه با استفاده از تکنيک‌هائي مانند: هيبريديداسيون اسيد هسته‌اي DNA-hybridisition))، آناليز آنتيژني و توانايي ارگانيسم در هيدروليز اوره، مايکوباکتريوم اسکوروفولاسئوم به راحتي از مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم اينتراسلولار قابل تقکيک است. واژه ديگري که بسيار کاربرد دارد کمپلکس مايکوباکتريوم آويوم (MAC) است که دربر گيرنده دو گونه مايکوباکتريوم آويوم و مايکوباکتريوم اينتراسلولار مي‌باشد که قبلا تحت گونه مجزا به نامهاي مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه آويوم، مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه پاراتوبرکلوزيس و مايکوباکتريوم آويوم تحت گونه سيلواتيکم تشکيل مي‌گرديد. در بين گروه مايکوباکتريوم آويوم، مايکوباکتريوم پاراتوبرکلوزيس به جهت نياز به مايکوباکيتين در محيط کشت از بقيه به راحتي قابل تفريق است (ميانگين تقسيم آن 48 ساعت ومدت زمان رشد حدود 16 هفته است) (Bull T.J and Shanson D.C., 1992).
معمولاً و نه الزاماً مايکوباکتريوم‌هاي فرصت طلب، پاتوژن‌هائي کند رشد با ميانگين تقسيم 42-12 ساعت بوده و ميانگين لازم براي رشد آنها در محيط کشت اختصاصي حدود 15 تا 28 روز است. البته اين در مورد مايکوباکتريوم لپره استثنا مي‌باشد که توانائي رشد بر روي محيط مصنوعي را نداشته و تکثير آن در حيوانات آزمايشگاهي بين 7 تا 14 روز بطول ميانجامد. در مقابل بسياري از پاتوژنهاي نادر يا گونه‌هاي ديگر مايکوباکتريوم‌هاي ساپروفيت هم وجود دارند که داراي رشد سريعي بوده و متوسط تقسيم آن‌ها بين 2 تا 6 ساعت متغير است و زمان لازم براي رشد روي محيط کشت، در مورد باکتري‌هاي اخير 1 تا 7 روز است (Salfinger M and Pfyffer G.E., 1994).
رانيون (Runyon) مايکوباکتريهاي آتيپيک را بر اساس خصوصيات فنوتيپي مثل داشتن رنگدانه و سرعت رشد به چهار گروه تقسيم‌بندي نمود. گروههاي يک، دو و سه تنها شامل مايکوباکتريهاي کند رشد بودند، مثل ارگانيسمهايي که به بيش از يک هفته زمان براي رشد نياز دارند، در حاليکه گروه چهار شامل گونه‌هاي سريع رشد بوده که به يک هفته يا کمتر زمان براي رشد نياز دارند.
2-3-1. فتو کروموژن37
گروه يک رانيون شامل گونه‌هاي ميباشد که کلنيهايشان تنها در حضور نور قابليت ايجاد رنگدانه را دارند (گونه‌هاي مهم آن از نقطه نظر پزشکي شامل مايکوباکتريوم کانزاسي و مايکوباکتريوم مارينوم مي‌باشد).
2-3-2. اسکوتوکروموژن38
گروه دوم شامل گونه‌هاي اسکوتوکروموژن بوده (کلنيهاي آنها در حضور و يا در غياب نور توليد رنگدانه مينمايد) که مي‌توان از مايکوباکتريوم گوردونه و مايکوباکتريوم اسکوروفولاسئوم نام برد.
2-3-3. غير کروموژن39
گروه سوم شامل گونههاي غير کروموژن ميباشند (کلنيهاي بدون رنگ ايجاد ميکنند) شامل مايکوباکتريوم آويوم، مايکوباکتريوم اينتراسلولار و مايکوباکتريوم گزنوپي ميباشند.
2-3-4. سريع الرشد40
گروه چهارم رانيون شامل مايکوباکتريومهاي سريع الرشد (گونههاي مهم از نظر پزشکي شامل مايکوباکتريوم فورتوئيتوم و مايکوباکتريوم شلونئي است) (David H.L. et al., 1987).
2-4. باکتريولوژي سل
گونههاي پاتوژنيک به کمپلکس مايکوباکترويوم توبرکلوزيس تعلق دارند. مايکوباکتريومها، باسيلهاي غيرمتحرک و بدون اسپور هستند. محتوي گوانين و سيتوزين (G+C) در اين باکتريها نزديک به 61-71% ميباشد. محتوي ليپيدي اين باکتريها احتمالا بيشتر از تمام باکتريها ميباشد. مايکوباکتريوم و ساير جنسهاي نزديک (کورينه باکتريها، گوردونا، تسوکامورلا، نوکارديا، رودوکوکوس و دايتزيا Dietzia)) داراي ساختار و ترکيبات ديواره سلولي مشابهاي هستند Barrera L., 2007)).
اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس، عوامل مختلفي هستند که توانايي ايجاد سل در انسان را دارند. اين عوامل از لحاظ ميزبان، مخزن و قابليت انتقال از حيوانات، از هم تفکيک ميشوند. M. tuberculosis و واريانتها يا زير تيپهاي منطقهاي مايکوباکتريوم افريکانوم (Mycobacterium africanum) و مايکوباکتريوم کانتي (Mycobacterium canetti) پاتوژن هاي اوليه در انسان هستند. مايکوباکتريوم بوويس (Mycobacterium bovis) و مايکوباکتريوم ميکروتي (Mycobacterium microti) عامل بيماري سل در حيوانات هستند که ميتوانند به انسان منتقل شوند. بعضي از سويه هاي خاص جدا شده از بزها و خوک هاي آبي به نام مايکوباکتريوم کاپره (Mycobacterium caprae) و مايکوباکتريوم پينيپدي (Mycobacterium pinnipedi) که گاهي به عنوان زيرگونه يا واريانتهايM. bovis نامگذاري ميشوند، نيز مي توانند باعث ايجاد بيماري در انسان شوند. شايد محيط هاي مختلف اين گونهها باعث تفاوتهاي مهم ميکروبيولوژيکي اعضاي اين کمپلکس شده است. گونههاي اشاره شده به همراه سويههاي واکسن BCG اعضاي کمپلکس را تشکيل ميدهند (جدول 2-1). شباهت بالاي ژنومي اعضاي کمپلکس نيز از نکات قابل ذکر ميباشد. البته روشهاي مولکولي براي تفريق گونههاي کمپلکس مايکوباکتريوم ابداع شده است Barrera L., 2007)).
توبرکلوزيس هنوز به عنوان يک معضل بهداشتي در دنيا مطرح مي باشد و تقريبا يک سوم از مردم دنيا به اين باکتري آلوده ميباشد. تخمين زده ميشود که بين سالهاي 2000 تا 2020 نزديک به 1 بيليون به ميکرب سل آلوده خواهند شد و 200 ميليون از اين جمعيت دچار بيماري شده و 35 ميليون نفر در اثر اين بيماري خواهند مرد (Boer As. et al.,1999). تشخيص اوليه به همراه درمان کافي و تدابير پيشگيري براي کنترل انتقال بيشتر بيماري سل مورد نياز ميباشد. بعلاوه به دليل ميزان بالاي اخير شيوع عفونتهاي ناشي از مايکوباکتريومهاي آتيپيک به ويژه در مبتلايان به ايدز و افراد دچار نقص ايمني، تشخيص درست وصحيح گونه مايکوباکتريايي براي اتخاذ تدابير درماني درست، ضروري ميباشد . (Neonakis I.K. et al., 2008)
جدول 2-1: تاکسونومي اعضاي کمپلکس توبرکلوزيس
2-5. مورفولوژي و خصوصيات ميکروسکوپي
باسيل سل انساني به صورت ميلهاي باريک، کمي خميده به طول 2 تا 4 ميکرون و قطر 2/0 تا 5/0 ميکرون است که قطر آن در تمام طول ممکن است يکسان باشد. ولي اغلب به صورت دانهدار با واکوئولهاي بيرنگ و دانههايي که به شدت رنگ پذيراند و به فواصل نامنظم از يکديگر قرار دارند ديده ميشود. در محيط کشت، اشکال کوکوئيد تا رشتهاي ممکن است ديده شود (Harrison T.R., 2003) )تصوير 2-2).
تصوير2-2: عکس برداري توسط ميکروسکوپ الکتروني ازM. tuberculosis
مطالعه با ميکروسکوپ الکتروني نشان ميدهد که مايکوباکتريومها پروکاريوت هستند و مواد هسته، از جمله DNA، به وسيله غشا از سيتوپلاسم جدا نيستند. شکل آنها به وسيله يک ديواره ضخيم و محکم شامل دو لايه حاجب- الکترون که به وسيله لايه کم تراکم ديگري از يکديگر جدا شدهاند حفظ ميشود و حذف ديواره سلولي به کمک مواد شيميايي، شکل ميلهاي آنها را به صورت ساختمان کروي يا اسفروپلاست تغيير ميدهد (. (Kohn., 1986
هسته مايکوباکتريومها شامل رشتههايي است که احتمالا يک مولکول DNA مارپيچي دراز به طول 30 آنگستروم ميباشند. به نظر ميرسد که مايکوباکتريها، ارگانيسمهاي يک هستهاي هستند. بررسيهاي بيوشيمايي نشان ميدهد که DNA مايکوباکتريومها يک مولکول دو رشتهاي حاوي مقادير زياد گوانين و سيتوزين است و وزن مولکولي آن در حدود 109× 6/4-5/2 دالتون برآورد شده است (Segundo A., et al., 2000 (Kohn., 1986 ; .
2-6. خصوصيات رشد
بر خلاف ساير باکتريهاي بيماريزا که بيهوازي يا هوازي اختياري هستند، باسيل سل هوازي اجباري است و ميتواند در محيطهاي کشت مصنوعي ساده حاوي گليسرين به عنوان منبع کربن و املاح آمونيوم به عنوان منبع ازت رشد کند. آسپاراژين يا مخلوطي از اسيدهاي آمينه معمولا به محيط کشت افزوده ميگردند تا شروع رشد را تسهيل و سرعت آن را بهبود بخشند. اگرچه مايکوباکتريومها به اثر مهار کننده مواد چربي در محيط کشت خيلي حساسند ولي مقادير اندک اسيدهاي چرب با زنجير طويل موجب تحريک آنها ميشوند.PH مناسب رشد مايکوباکتريوم توبرکلوزيس حدود 6 تا 8 و pH متوسط 8/ 6- 5/6 است اختصاصات رشد بر حسب سويه باسيل، محيط رشد و غيره متفاوت است. رشد باسيل سل در محيطهاي کشت جامد، مثل محيط تخم مرغ، انبوه و فراوان است و پرگنهها برجسته، زبر با ظاهري گل کلمي يا مخروطي نا منظم، خشک و شکننده ميباشد (تصوير2-3). سرعت رشد باسيل سل چه در محيط کشت و چه در بدن حيوانات کند است ولي بعضي از مايکوباکتريومهاي ساپروفيت رشد سريعتري دارند و به طور کلي سرعت رشد مايکوباکتريومها خيلي آهسته تر از ساير باکتريها است (Segundo A. et al., 2000 ; Kohn., 1986).
تصوير2-3: کلنيهايM. tuberculosis روي محيط لونشتاين جانسون
2-7. فيزيولوژي مايکوباکتريوم توبرکلوزيس
مايکوباکتريومها در حين عفونت به جاي چرخه کربس از چرخه گلي اکسالات استفاده ميکنند (Barrera., 2007).
به خاطر وجود مايکوليک اسيد41 در ديواره سلولي مايکوباکتريومها، به صورت يک لايه محافظ ميباشد که باکتري را در مقابل دزانفکتانها، ترکيبات سمي و آنتيبيوتيکها مقاوم ميکند (Neonakis I.K. et al., 2008).
در انتقال مواد غذايي در مايکوباکتريومها غشاء داخلي و غشاء خارجي دخالت دارند.
2- 7- 1. انتقال مواد غذايي توسط غشاء خارجي
انتقال ترکيبات هيدروفيليک
پورينها پروتئينهاي غيراختصاصي ميباشند که تشکيل کانالهايي را ميدهند که در انتقال ترکيبات هيدروفيليک در باکتريها نقش دارند اولين پورين کشف شده در مايکوباکتريومها mspA ميباشد و حذف آن در مايکوباکتريوم اسمگماتيس جذب سفالوسپورين و گلوکز را به ترتيب 9 و 4 برابر کم ميکند و حذف آن سبب کاهش رشد ميکروبها ميشود . (Stahl C. et al., 2001)
انتقال ترکيبات هيدروفوبيک
ترکيبات هيدروفوبيک (غير الکتروليتها) به راحتي ميتوانند از غشاء خارجي عبور کنند با توجه به اينکه غشاء خارجي به صورت نامتقارن و هيدروفوب ميباشد و بيشترين نقل و انتقال در غشاء خارجي در دماي 70-60 درجه سانتيگراد صورت ميپذيرد و در اين دما ليپيدها بيشترين کاهش سياليت غشاء را دارند. و مايکوليک اسيد نقش زيادي در ميزان سياليت غشاء دارد و مواد هيدروفوبيک جهت عبور از غشاء بايد ابتدا در چربي حل شوند و به علت انتقال راحتتر چربيها نسبت به مواد قندي اين ترکيبات به عنوان منبع کربن ميباشند و مشخص ميشود که چرا آنزيم ايزوسيترات لياز (isocitrate lyase) جهت رشد و بقاء M. tuberculosis در درون ماکروفاژ لازم ميباشد و بيان ژنهايي که در اکسيداسيون اسيدهاي چرب نقش دارند افزايش مييابد .( Liu J. et al., 1995)
2-7-2. انتقال توسط غشاء داخلي
2-7-2-1. انتقال ترکيبات حاوي کربن
کربوهيدراتها
سيستم ABC و FMS در انتقال کربوهيدارتها در مايکوباکتريومها دخالت دارند به اثبات رسيده است که سيستمهاي ABC که در انتقال کربوهيدراتها نقش دارند در افزايش ويرولانسM. tuberculosis در موش نيز نقش دارند با توجه به اينکه در شرايط در شيشه گليسرول به عنوان منبع کربن ميباشد ولي هيچگونه پرمئازي در رابطه با آن تا به حال شناخته نشده است (Schanappinger D. et al., 2003).
انتقال ترکيبات حاوي کربن- ليپيد
بعد از عفونت، منبع کربن از کربوهيدراتها به ليپيدها تغيير ميکنند و آنزيمهاي ايزوسيترات لياز و مالئاتسنتتاز maleate synthesis)) جهت ويرولانس لازم ميباشند و اين به آن معنا ميباشد که ليپيدها در حين عفونت به عنوان منبع کربن در مايکوباکتريومها ميباشند و چرخه گلياکسالات ضروري ميباشند و بتا اکسيداسيون ليپيدها رخ ميدهد .(Paula S. et al., 1996)
2-7-2-2. انتقال ترکيبات غير کربن
فسفر جهت تامين سنتز DNA و فسفوليپيدها در داخل باکتري ضروري ميباشد و فسفر در داخل ماکروفاژها جهت استفاده مايکوباکتريومها محدود ميباشد جهت رشد و تکثير مايکوباکتريومها در داخل ماکروفاژها ضروري ميباشد و بعد از ايجاد عفونت بيان ژنهايي که در انتقال فسفر به داخل ميکروب نقش دارند افزايش مييابد و پورينها قادر به انتقال فسفر به داخل باکتري ميباشند (Wheeler P.R. et al., 1990).
انتقال سولفور
سولفور جهت شروع ترجمه و مسيرهاي احيايي در داخل سلول باکتري ضروري ميباشد و در حالت در شيشه، متيونين تامين کننده يون سولفات ميباشد ولي در شرايط زنده متيونين بيشتر تامينکننده يون سولفور ميباشد و ژنهاي cysA و subl در واقع به عنوان ژنهاي کد کننده انتقال متيونين ميباشند و جهش در اين ژنها هيچ تاثيري در بقاء مايکوباکتريومها ندارد پس مشخص ميشود که يک پرمئاز سولفات را درM. tuberculosis ميتوان پيشبيني کرد که جهش ژنهاي cysA و subl را جبران کند (Braibant M. et al., 1996).
انتقال نيتروژن
در بسياري از باکتريها آمونيوم به عنوان منبع ازت شناخته شده است در محيطهايي با غلظت بالاي آمونيوم، گاز آمونياک از غشاء عبور کرده و ازت سلول را تامين ميکند ولي در حالت کمبود آمونيوم محيط باعث سنتز ژن amtB ميشود و همولوگ اين ژن درM. tuberculosis وجود دارد (Content J. et al., 2005) و در داخل ماکروفاژ که NO توليد ميشود اگرNO توليد شود توليد نيترات ميکند که يک منبع ازت براي باکتري در داخل ماکروفاژ ميباشد در داخلM. tuberculosis 4 ژن بنامهاي narU و nark1-3 وجود دارد که در وارد کردن نيترات و خروج نيتريت نقش دارند زيراM. tuberculosis قادر به احياي نيتريت نميباشد و انباشتگي آن براي سلول سمي ميباشدNolden L. et al., 2001) ). در شرايط کمبود اکسيژن و در هنگام انتقال الکترون از سيتوکروم اکسيداز نيترات به عنوان گيرنده نهايي الکترون به جاي اکسيژن قرار ميگيرد و انتقال نيترات در اين اين شرايط توسط nark2 انجام ميشود و بيان اين ژن توسط سيستم DosR/DouR کنترل ميشود که در پاسخ هيپوکسي و NO ميزان بيان nark2 را افزايش ميدهد (Braibant M. et al., (1996.
انتقال کاتيونها
يونهاي فلزي از جمله آهن، مس و روي نقش ساختاري و کاتاليکي در متالوپروتئينها42 و آنزيمها دارند در مايکوباکتريومها دو ژن در رابطه با ذخيره سازي و انتقال يونهاي فوق شناخته شده است آهن در همه آنزيمهايي که عملکرد احيايي دارند وجود دارد سيدروفورها در انتقال و ذخيره آهن در ميکروب سل نقش دارند و به دو شکل قطبي و غيرقطبي وجود دارند و شکل غيرقطبي آن مايکوباکتين (سيدروفورهاي حاوي سالسيلات) ميباشد که در ذخيرهسازي آهن در ميکروب نقش دارد و شکل قطبي آن به صورت کربوکسي مايوباکتين ميباشد که در نقل و انتقال آهن نقش دارد . (Lichtinger T. et al., 1999) در خارج از باکتري Fe3 به مايکوباکتين متصل ميشود و به يک رسپتور ويژه که بر روي ديواره سلولي قرار دارد متصل شده و سپس از طريق ATP-binding casset وارد باکتري ميشود و در داخل باکتري Fe3 متصل به مايکوباکتين احياء شده و تبديل به Fe2 ميشود و از آن جدا ميشود.
جهش در ژن کد کننده ATP-binding casset سبب مرگ ميکروب نميشود پس يکسري ژنها در رابطه با کسب آهن در وجود دارند که هنوز شناخته نشدهاند Nolden L. et al., 2001)).
2-8. فاکتورهاي ويرولانس
وقتي که ذرات حاوي ميکروب از طريق هوا وارد ريه ميشوند امکان دارد 3 حالت پيش بيايد:
1- سيستم ايمني تمام باسيلها را حذف ميکند.
2- سيستم ايمني ميکروبها را از بين نبرده و از حالت عفونت به سرعت تبديل به بيماري ميشوند.
3- عفونت ايجاد ميشود ولي فرد وارد مرحله بيماري نميشود و ميکروبها در حالت نهفته در ريه باقي ميمانند.
ايجاد حالتهاي فوق به توان سيستم ايمني بدن و فاکتورهاي ويرولانس ميکروب بستگي دارد.
يکي ازعوامل ويرولانس در مايکوباکتريومها، آنزيم گلوتامين سنتتاز glutamine synthetase)) ميباشد، اين آنزيم در ساخت گلوتامين نقش دارد و حذف آن باعث کاهش تکثير باسيل سل به ميزان 10 برابر کمتر از سوش وحشي در خوکچه هندي ميشود ولي در موش فقط مرگ را به تاخير مياندازد.
آنزيم ايزوسيترات لياز نيز يک آنزيم دخيل کننده در ويرولانس ميباشد و حذف آن سبب ميشود که گوکز کمتري در حين عفونت در اختيار باسيل سل قرار گيرد و جهش در ژن کد کننده مولکولهايي که در جذب و نگهداري مواد نقش دارد نيز سبب کاهش حدتM. tuberculosis ميشود مانند ژنهاي pstS2-pstS1-RV0072-modA که به ترتيب در جذب آهن، موليبدن، فسفات و گلوتامين نقش دارند و حذف اين ژنها سبب کاهش حدت مايکوباکتريومها ميشود چندين مطالعه نشان ميدهد که بين کاهش اکسيژن و ويرولانس رابطهاي وجود دارد و کاهش اکسيژن سبب افزايش ويرولانس ميشود (Comacho L. et al., 1999).
2-9. ديواره سلولي
ضخامت ديواره سلولي حدود 100 تا 200 آنگستروم است.



قیمت: تومان

این نوشته در مقالات و پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید